HPLC

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Sejarah HPLC ditemukan sebelum tahun 1970-an, beberapa metode kromatografi dapat diandalkan komersial tersedia untuk ilmuwan laboratorium. Selama 1970-an, sebagian besar pemisahan kimia dilaksanakan menggunakan berbagai teknik termasuk terbuka kromatografi kolom, kromatografi kertas, dan kromatografi lapis tipis. . Namun, teknik-teknik kromatografi ini tidak memadai untuk kuantifikasi senyawa dan resolusi antara senyawa yang serupa. Selama waktu ini, kromatografi cairan tekanan mulai digunakan untuk mengurangi flowthrough waktu, sehingga mengurangi waktu pemurnian senyawa yang terisolasi oleh kolom chromatogaphy. Namun, laju aliran tidak konsisten, dan pertanyaan apakah lebih baik untuk memiliki laju aliran konstan atau tekanan konstan diperdebatkan. (Analytical Chem. vol 62, no. 19, oct 1 1990). (Analytical Chem. Vol 62, no. 19, 1 Oktober 1990).

Kromatografi cairan tekanan tinggi dikembangkan pada pertengahan tahun 1970-an dan segera ditingkatkan dengan pengembangan bahan kemasan kolom dan kenyamanan tambahan on-line detektor. Pada akhir 1970-an, metode baru termasuk fase terbalik kromatografi cair yang diperbolehkan untuk meningkatkan pemisahan antara senyawa yang sangat mirip. Pada tahun 1980-an HPLC sering digunakan untuk pemisahan senyawa kimia. Meningkatkan teknik-teknik baru pemisahan, identifikasi, pemurnian dan kuantifikasi jauh di atas teknik-teknik sebelumnya. Komputer dan otomatisasi menambah kenyamanan HPLC. Perbaikan dalam kolom jenis dan dengan demikian reproduktifitas dibuat sebagai istilah-istilah seperti mikro-kolom, kolom afinitas, dan Fast HPLC mulai immerge.

Dimensi kolom HPLC yang khas adalah: XXX mm panjang dengan diameter internal antara 3-5 mm. Diameter yang biasa mikro-kolom, atau kolom kapiler, berkisar dari 3 μm sampai 200 μm. Fast HPLC menggunakan kolom yang lebih singkat dari kolom yang khas, dengan panjang sekitar 3 mm lama, dan mereka dipenuhi dengan partikel yang lebih kecil.

1.2  Rumusan Masalah

1.      Bagaimanakah teori dasar serta prinsip dasar dari HPLC ?

2.      Bagaimanakah penggunaan / penerapan HPLC dalam proses analisis kimia?

BAB II

ISI

2.1  Pengertian HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

HPLC adalah metode analisis yang populer karena mudah untuk dipelajari dan digunakan dan tidak dibatasi oleh volatilitas atau stabilitas senyawa sampel. sejarah bagian HPLC menggambarkan evolusi dari tahun 1970 ke tahun 1990-an. HPLC modern memiliki banyak aplikasi termasuk pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan kuantifikasi dari berbagai senyawa.

Kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC) adalah sebuah bentuk kromatografi cair untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terlarut dalam larutan. Alat HPLC terdiri dari sebuah waduk fase gerak, sebuah fase stasioner, sebuah pompa, sebuah injektor, sebuah kolom pisah, dan sebuah detektor. Senyawa-senyawa dipisahkan dengan menginjeksikan campuran sampel ke dalam kolom. Komponen-komponen yang berbeda dalam campuran ini melewati kolom dengan kecepatan berbeda-beda akibat perbedaan perilaku penyekatannya antara fase cair (gerak) dan fase stasioner.

Pada instrumen HPLC, pelarut-pelarut harus dihawagaskan (dihilangkan komponen gasnya) untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung. Pompa memberikan tekanan tinggi yang tetap tanpa berpulsasi, dan bisa diprogramkan untuk memvariasikan komposisi pelarut selama berlangsungnya pemisahan. Detektor-detektor bergantung pada perubahan indeks refraktif, serapan UV-tampak, atau fluoresensi setelah eksitasi dengan panjang gelombang yang sesuai. Berikut ini adalah skema dari sebuah instrumen HPLC.

Sebuah HPLC adalah komponen yang mengemisikan sebuah respon akibat senyawa sampel yang terelusi dan selajutnya memberi sinyal sebuah puncak pada kromatogram. Detektor ini terletak tepat dibelakang fase stasioner untuk mendeteksi senyawa-senyawa pada saat terelusi dari kolom. Luas-bidang dan tinggi puncak biasanya bisa disesuaikan dengan menggunakan kontrol tuning yang kasar dan halus, dan parameter deteksi dan kesensitifan juga bisa dikontrol (pada kebanyakan kasus). Ada banyak tipe detektor yang bisa digunakan dengan HPLC. Beberapa detektor yang umum antara lain: Indeks Refraksi (RI), Utlra-Violet (UV), Fluorescent, Radiokimia, Elektrokimia, Mendekati-Infra Merah (Near-MS), Spektroskopi Massa (MS), NMR, dan Penghamburan Cahaya (LS).

2.2  Macam fase pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

1.      Fase Gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah pelarut yang secara terus menerus dimasukkan ke dalam kolom, atau fase stasioner. Fase gerak berfungsi sebagai pengangkut larutan sampel. Larutan sampel diinjeksikan ke dalam fase gerak melalui sebuah lubang injektor. Pada saat larutan sampel mengalir dalam sebuah kolom bersama-sama dengan fase gerak, komponen-komponen dari larutan ini akan bermigrasi menurut interaksi-interaksi non-kovalen dari senyawa dengan kolom. Interaksi kimia fase gerak dan sampel, dengan kolom, menentukan tingkat migrasi dan pemisahan komponen yang terdapat dalam sampel. Sebagai contoh, sampel-sampel yang memiliki interaksi lebih kuat dengan fase gerak dibanding dengan fase diam akan lebih cepat terelusi dari kolom, sehingga memiliki waktu retensi yang lebih singkat dan sebaliknya. Fase gerak bisa diubah untuk memanipulasi interaksi  sampel dan fase stasioner. Ada beberapa jenis fase gerak yaitu: isokratis, gradien, dan polytyptic.

Pada elusi isokratis senyawa-senyawa dielusi dengan menggunakan komposisi fase gerak yang konstan. Semua senyawa mulai bermigrasi dalam kolom pada saat analisis dimulai. Akan tetapi, masing-masing bermigrasi dengan kecepatan berbeda, sehingga ada laju elusi yang cepat dan lambat. Tipe elusi ini sederhana dan tidak mahal, tetapi resolusi beberapa senyawa dipertanyakan dan elusi tidak bisa diperoleh dalam waktu singkat.

Pada elusi gradien, senyawa-senyawa dielusi dengan meningkatkan kekuatan pelarut organik. Sampel diinjeksikan sambil sebuah fase gerak yang lebih lemah diaplikasikan ke dalam sistem. Kekuatan fase gerak selanjutnya ditingkatkan dengan menambah fraksi pelarut organik, yang selanjutnya menghasilkan elusi komponen tertinggal. Ini biasanya dilakukan secara bertahap atau linear.

Fase gerak polytyptic, terkadang disebut sebagai kromatografi mode bercampur, adalah sebuah metode serbaguna dimana beberapa tipe tehnik kromatografi bisa menggunakan kolom yang sama. Kolom-kolom ini mengnadung resin-resin hidrofob makro-pori yang kaku, yang terikat secara kovalen dengan sebuah lapisan organik hidrofil. SEC, IEC, kromatografi hidrofob, atau kromatografi afinitas adalah beberapa metode yang bisa digunakan. Dengan mengubah fase gerak, cara pemisahan berarti dapat diubah sehingga memungkinkan operator kromatografi mencapai selektivitas yang diinginkan dalam pemisahan.

2.      Fase Stasioner

Fase stasioner dalam HPLC adalah pendukung padat yang terdapat dalam kolom yang di dalamnya fase gerak terus mengalir. Larutan sampel diinjeksikan ke dalam fase gerak pengujian melalui lubang injektor. Ketika larutan sampel mengair bersama dengan fase gerak dalam fase stasioner, komponen-komponen larutan tersebut akan bermigrasi menurut interaksi non-kovalen dari senyawa dengan fase stasioner. Interaksi kimia, dari fase stasioner dan sampel dengan fase gerak, menentukan tingkat migrasi dan pemisahan komponen-komponen yang terdapat dalam sampel. Sebagai contoh, sampel-sampel yang memiliki interaksi lebih kuat dengan fase stasioner dibanding dengan fase gerak akan terelusi dari kolom lebih lambat, sehingga memiliki waktu retensi yang lebih lama dan sebaliknya.

Kolom-kolom yang mengandung berbagai jenis fase stasioner telah banyak diperdagangkan. Beberapa fase stasioner yang umum antara lain: Cair-Cair, Padat-Padat (Adsorpsi), Size Exclusion, Fase Normal, Fase Terbalik, Pertukaran Ion, dan Afinitas.

Pompa-Pompa HPLC

Ada beberapa tipe pompa yang tersedia untuk digunakan dalam analisis HPLC, yaitu: Pompa Piston Berbalas, Pompa Tipe Semprot, dan Pompa Tekanan Konstan.

Pompa Piston Berbalas terdiri dari sebuah piston yang dikendalikan oleh sebuah motor kecil, yang bergerak cepat ke depan dan ke belakang dalam sebuah bilik hidrolik yang bisa bervariasi volumenya mulai dari 35 – 400 μL. Pada gerakan ke belakang, katup kolom pemisah tertutup, dan piston menarik pelarut dari waduk fase gerak. Pada gerakan ke depan, pompa menekan pelarut keluar dari kolom dari waduk. Banyak laju aliran yang bisa dipertahankan dengan mengubah volume gerakan piston selama masing-masing siklus, atau dengan mengubah frekuensi gerakan. Pompa dengan kepala dua atau tiga terdiri dari unit-unit ruang piston identik yang beroperasi pada 180 atau 120 derajat dari fase. Tipe sistem pompa ini jauh lebih halus karena salah satu pompa sedang terisi sedang yang lainnya kosong.

Pompa Tipe Semprot paling cocok untuk kolom-kolom yang berlubang karena pompa ini hanya menyalurkan volume fase gerak tertentu sebelum harus diisi ulang. Pompa-pompa ini memiliki volume antara 250 hingga 500 mL. Pompa beroperasi dengan sekrup motor yang menyalurka fase gerak ke kolom dengan laju konstan. Laju penyaluran pelarut dikendalikan dengan mengubah tegangan pada motor.

Pada Pompa Tekanan Konstan fase gerak disalurkan melalui kolom dengan menggunakan tekanan dari sebuah silinder gas. Sebuah sumber gas bertekanan rendah diperlukan untuk menghasilkan tekanan cair yang tinggi. Tatanan pengatupan memungkinkan pengisian ulang ruang pelarut dengan cepat yang memiliki kapasias sekitar 70 mL. Ini memberikan laju aliran fase gerak yang kontinyu.

Injektor untuk HPLC

Sampel-sampel diinjeksikan ke dalam HPLC melalui sebuah lubang injeksi. Lubang injeksi ini biasanya terdiri dari sebuah katup injeksi dan loop sampel. Sampel biasanya dilarutkan dalam fase gerak sebelum injeksi ke dalam loop sampel. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam sebuah semprot dan diinjeksikan ke dalam loop melalui katup injeksi.

Pemutaran rotor katup akan menutup katup dan membuka loop untuk menginjeksikan sampel ke dalam aliran fase gerak. Volume katup bisa berkisar antara 10 μl sampai lebih dari 500 μl. Pada sistem HPLC modern, injeksi sampel biasanya otomatis.

Injeksi stopped-flow merupakan sebuah metode dimana pemompaan dihentikan sehingga memungkinkan lubang injeksi mendapatkan tekanan atmosfir. Pipa semprot yang mengandung sampel kemudian diinjeksikan ke dalam katup dengan cara biasa, aliran dalam kolom bisa dijadikan nol dan dengan rdapat di depan injektor. Metode ini bisa digunakan sampai pada tekanan yang sangat tinggi.

Kolom Detektor dan Batas Deteksi

Detektor untuk cepat dilanjutkan dengan mengalihkan fase gerak menggunakan katup tiga-arah.

Prinsip Kerja Padat-Padat

Senyawa-senyawa yang memiliki gugus-gugus fungsional yang mampu terikat dengan ikatan hidrogen yang kuat akan menempel lebih kuat ke fase stasioner dibanding senyawa-senyawa yang kurang polar. Sehingga, senyawa-senyawa yang kurang polar akan terelusi dari kolom lebih cepat dibanding senyawa-senyawa yang sangat polar.

Prinsip kerja Cair-Cair

Sama dengan padat-padat akan tetapi, tehnik ini lebih cocok untuk sampel-sampel yang memiliki polaritas sedang yang dapat larut dalam pelarut organik yang sedikit polar sampai yang polar. Pemisahan non-elektrolit dicapai dengan mencocokkan polaritas sampel dan fase stasioner dan dengan menggunakan sebuah fase gerak yang memiliki polaritas yang jauh berbeda.

Prinsip kerja Size-Exclusion

Didasarkan pada ukuran molekul senyawa yang sedang dianalisis. Fase stasioner terdiri dari butiran-butiran berpori. Senyawa-senyawa yang lebih besar akan dikeluarkan dari bagian interior butiran sehingga akan terelusi pertama kali. Senyawa-senyawa yang lebih kecil akan dibiarkan memasuki butiran-butiran dan akan terelusi menurut kemampuan mereka untuk keluar dari pori-pori berukuran sama dengan tempat sebelumnya. Kolom bisa berbasis silika atau non-silika. Akan tetapi, ada beberapa size-exclusion yang merupakan anionik lemah dan sedikit hidrofobik yang menimbulkan perilaku size-exclusion yang non-ideal.

Prinsip kerja Fase Normal

Didasarkan pada kehidrofoban dan lifofilitas dengan menggunakan sebuah fase stasioner polar dan sebuah fase gerak yang kurang polar. Sehingga, senyawa-senyawa hidrofob terelusi lebih cepat dibanding senyawa-senyawa hidrofil.

Prinsip kerja Fase Terbalik

Didasarkan pada kehidrofoban dan lifofilitas. Fase stasioner terdiri dari kolom yang berbasis rantai n-alkil yang terikat secara kovalen. Sebagai contoh, C-8 dapat menandakan sebuah rantai oktil dan C-18 menandakan ligan oktadesil dalam matriks. Semakin hidrofob matriks pada masing-masing ligan, semakin besar kecenderungan kolom untuk mempertahankan gugus-gugus hidrofob. Sehingga senyawa-senyawa hidrofil terelusi lebih cepat dibanding senyawa-senyawa hidrofob.

Prinsip kerja Pertukaran Ion

Didasarkan pada pertukaran ion secara selektif dalam sampel dengan ion sebanding di fase stasioner. Pertukaran Ion dilakukan dengan kolom-kolom yang mengandung gugus fungsional bermuatan yang terikat pada sebuah matriks polimer. Ion-ion fungsional terikat permaen dengan kolom dan masing-masing memiliki ion sebanding yang terikat. Sampel dipertahankan dengan mengganti ion-ion sebandng dari fase stasioner dengan ion-ionnya sendiri. Sampel dielusi dari kolom dengan mengubah sifat-sifat fase gerak sehingga fase gerak akan menggeser ion-ion sampel dari fase stasioner (yaitu dengan mengubah pH).

Prinsip kerja Afinitas

Didasarkan pada biokimia terimobilisasi yang memiliki afinitas spesifik terhadap senyawa yang diinginkan. Pemisahan terjadi pada saat fase gerak dan sampel melewati fase stasioner. Senyawa sampel atau senyawa yang target dipertahankan sebagai sisa zat pengotor dan fase gerak lewat. Senyawa-senyawa kemudian dielusi dengan mengubah kondisi-kondisi fase gerak.

2.4 Bagian-Bagian pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

1. Komponen pada HPLC

Komponen terpenting yang terdapat pada peralatan HPLC adalah pompa, injector, kolom,detector, dan rekorder, integrator atau pengolah data. Pompa terdapat dua sistem pompa yaitu internal dan eksternal. Pada sistem internal, pompa dihidupkan, set laju aliran 0.1 mL/menit, tunggu sampai suhu kolom diatas 60°C, kemudian naikkan laju alirannya menjadi 0.5 mL/menit (setting ini berbeda untuk analisis zat yang lain). Sambil menunggu suhu kolom maka keluarkan gelembung udara pada pompa dengan bantuan syringe.

Pada sistem eksternal digunakan dua buah pompa, untuk campuran pelarut. Misalnya untuk memperbaiki pemisahan pada puncak yang terlalu dekat. Caranya dengan mengubah switch yang terletak pada panel belakang pompa dengan gradient controller. Buat program yang sesuai dengan pada gradient controller. Kolom dan pelarut
Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

2.Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

3.Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Instrumen-instrumen HPLC terdiri dari sebuah waduk fase gerak, sebuah fase stasioner, sebuah pompa, sebuah injektor, sebuah kolom pemisah, dan sebuah detektor. Tipe-tipe fase gerak adalah isokratis, gradien, dan polytyptic. Beberapa dari fase stasioner yang umum antara lain: Kolom Pelindung, Kolom Pengurai, Kolom Kapiler, Kolom Cepat, dan Kolom Pemisah. Beberapa dari detektor yang umum antara lain: detektor untuk Indeks Refraktif (RI), Ultra-Violet (UV), Fluorescent, dll.