ANALISA ASAM AMINO DENGAN METODE HPLC

            Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah alat yang ampuh untuk digunakn dalam analisis. Pada darsarnya sebuah bentuk yang sangat baik dari kromtografi kolom. Selain dari pelrut yang menetes melalui kolom yang menetes di bawah gravitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal itu yang membuat kerja ini menjadi lebih cepat dan akurat. HPLC juga memungkinkan untuk digunakan pada ukuran partikel yang sangat jauh lebih kecil untuk bahan kemasan kolom yang memberikan luas permukaanyang jauh lebih besar untuk interaksi antara fase diam dan molekul-molekul yang mengalir melewatinya.

Prinsip dari kerja HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya, untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan di hitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuntitatif). Alatnya terdiri dari kolom sebgai fase diam dan larutan tertentu sebagai fase geraknya.  Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal, dan transfer massa tidak seimbang. Sedangakan parameter-parameter yang menentukan berlangsungnya proses-proses tersebut adalah : laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dan ketebalan stasioner.

Protein merupakn sumber asam-asam amino yang mengandung unsure C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Asam amino diklasifikasikan menjadi taga yaitu diantaranya asam amino esensial, asam amino semi-esensial, dan asam amino non-esensial.

Analisa asm amino dapat dilakukan dengan menggunakan metode HPLC dengan menggunakan OPA sebagai reagen, caranya yaitu sebagai berikut :

1.      Menyiapkan bahan : asam amino standar (Merck), o-ftalaldehiluka), MPA (Fluka), ME (Fluka), Acetonotril pro HPLC (J.T. Baker), metanol pro HPLC (Merck), Na2HPO4 (Merck), aquabidestilata (IPHA), buffer borate pH 10,2 (Agilent), asam amino (Merck), asam phospat, NaOH, dan natrium metabisulfit.

2.      Menyiapkan alat : Kromatografi cair (HP 1100 QuatPump), kolom kromatografi Zorbax Eclipse AAA 150 x 4,6 mm ukuran partikel 5 mikron (Agilent Tecnologies), spektrofotometer ultraviolet (Beckman Du 650i), pH meter (Beckman), timbangan (Mettler AG104), Vortex, dan alat gelas yang biasa dipakai di laboratorium analitik.

3.      Membuat larutan dan reagen OPA sebagai berikut :

a.       Pembuatan larutan asam amino

Pembuatan dilakukan dengan menimbang sejumlah asam amino kemudian dimasukkan dalam labu takar kemudian diencerkan dengan aquabidestilata sampai volumenya 10 ml. Konsentrasi akhir dari asam amino asparagin 6,45 mg/ml, serin 4,6 mg/ml, histidin 4,44 mg/ml, arginin 10,6 mg/ml, lisin 25,6 mg/ml, metionin 1,5 mg/ml, valine 5,3 mg/ml, fenilalanin 2,7 mg/ml, dan leusin 5,4 mg/ml.

b.      Pembuatan reagen OPA

Ditimbang sebanyak 270,0 mg OPA ditambahkan 1,0 ml metanol, 200 μL merkapto propionic acid, divortex, kemudian diencerkan dengan dapar borat pH 10,2 sampai volume 5 mL Dipipet 1000 μl OPA-MPA tambahkan 1000 μl bufer borat pH 10,2 vortek selama 1 menit kemudian siap digunakan untuk reaksi derivatisasi

4.      Melakukan analisa.

a.       Pemilihan Panjang Gelombang Deteksi pada Daerah Ultraviolet
      Sejumlah tertentu larutan baku induk masing-masing asam amino diencerkan dengan fase gerakkemudian dilakukan pembacaan spektrum absorbsi masing-masing senyawa pada rentang panjang gelombang 200-400 nm. Semua spektrum absorbsi asam amino ditampilkan secara tumpang tindih (overlay) sehingga dapat ditentukan panjang gelombang yang dapat digunakan untuk
mendeteksi semua asam amino yang diuji.

b.      . Penentuan stabilitas intensitas fluorosensi hasil reaksi OPA/MPA dan OPA/ME
      Pipet 100 μL OPA-MPA dan 100 μL asam amino selanjutnya ditambahkan fase gerak sampai 2 mL kemudian divorteks. Larutan dimasukkan ke kuvet dan dilakukan pengukuran spektrofluorometri pada panjang gelombang eksitasi 335 nm dan panjang gelombang emisi 450 nm kemudian rekam intensitas fluorosensi selama 30 menit.

Dari analisa didapatka hasil Panjang gelombang maksimum eksitasi adalah 335 nm dan panjang gelombang emisinya 450 nm. Hasil reaksi OPA/MPA dengan asam amino memiliki intensitas fluorosensi yang tidak berbeda bermakna dengan hasil reaksi OPA/ME asam amino. Konsentrasi optimum yang digunakan untuk mendapatkan intesitas dan stabilitas yang baik dalam penelitian ini adalah konsentrasi 27 mg/ml.