BAB X. KROMATOGRAFI KERTAS DAN KAROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Tujuan percobaan

Setelah mempelajari teori dan melaksanakan praktek, mahasiswa diharapkan dapat memahami cara menganalisis komponen kimia dalam bahan hasil pertanian dan pangan dengan menggunakan kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis.

Dasar percobaan

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran zat berdasarkan sifat fisik dari zat penyusun campuran zat-zat tersebut. Sifat fisik tersebut khususnya :

1.    Adanya tendensi molekul suatu zat untuk larut dalam suatu pelarut

2.    Adanya tendensi molekul suatu zat untuk teradsorpsi pada permukaan zat padat yang halus dengan permukaan yang luas

3.    Adanya tendensi molekul suatu zat untuk menguap.

Kromatografi mula-mula dipakai untuk memisahkan pigmen tanaman, menggunakan kromatografi kertas.  Kertas yang dapat dipakai seperti : kertas whatman no. 541, no.2 atau no.3. kertas Whatman no. 541 memiliki kecepatan aliran pelarut cepat, no.3 sedang dan no.2 lambat, dalam memisahkan campuran secara kromatografi. Identifikasi noda-noda pada kertas kromatografi dinilai dari harga Rf (Retention Factor) dari sampel dan standar. Spot dengan nilai Rf yang sama dengan standar menunjukkan kandungan senyawa yang sama.

Tabel 1. Menunjukkan jenis pelarut yang dapat digunakan dalam pemisahan campuran zat.

Tabel 1. Perbandingan dan Jenis Pelarut yang dipakai dalam Kromatografi Kertas

Pelarut	Perbandingan	Pemisahan sampel
Fenol/air	Larutan jenuh	Asam amino
n-butanol/as.asetat/air	4:1:5	Asam amino
Etil asetat/piridin/air	2:1:2	Karbohidrat
Etil asetat/as.asetat/air	3:1:3	Karbohidrat
n-butanol/NH3	Jenuh	Asam-asam lemak

Kromatografi lapis tipis adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan lempeng plastik atau kaca yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika-gel, atau bahan serbuk (adsorben) lainnya. Medium ini dikatakan sebagai fase stasioner. Sedangkan pelarut yang digunakan untuk melarutkan fraksi atau komponen penyusun bahan dalam fase stasioner disebut sebagai larutan pengembang. Masing-masing komponen memiliki polaritas yang berbeda, apabila digunakan lempeng plastik atau kaca yang dilapisi dengan adsorben yang sifatnya polar, komponen yang sifatnya polar akan cenderung ter-adsorbsi pada adsorben dan tertahan pada fase stasioner ini, sedangkan komponen yang sifatnya lebih non polar akan ber-partisi dengan pengembang. Dengan demikian pemisahan masing-masing komponen akan terjadi. Jadi komponen yang paling non polar akan bergerak paling jauh (Christie, 2007).

Kromatografi lapis tipis merupakan metoda analisa yang cepat untuk dapat memisahkan dan identifikasi beragam komponen berdasarkan polaritasnya. Sama halnya dengan HPLC yang juga dapat digunakan untuk analisis fosfolipid dalam minyak nabati, namun kelebihan kromatografi lapis tipis ini dapat digunakan untuk analisa sampel yang kasar (tidak murni) dibandingkan dengan HPLC (Padley, et al., 1994). Kuantifikasi masing-masing komponen yang terpisah dapat dilakukan dengan alat densitometer, sering dinyatakan sebagai TLC-Scanner. Scanner dapat menganalisis lebih dari 20 sampel sekaligus yang ada pada plat KLT pada satu waktu sebagaimana analisa HPLC. Densitometri in situ pada plat kromatografi secara langsung dapat menentukan konsentrasi dari analit berdasarkan absorptiometri (Nzai and Proctor, 1998). 

Percobaan 1. Kromatografi Kertas

Prosedur kerja :

1.      Gunting kertas whatman no.2 ukuran 20x20cm

2.      Ditandai 1,5 cm dari bagian bawah kertas sebagai titik start

3.      Spotkan sampel, jarak antar spot +/- 1,5 cm

4.      Dilakukan pengembangan dalam bejana yang berisi larutan pengembang yang sesuai

5.      Pengembangan dilakukan sampai jarak tempuh pelarut 1 cm dari bagian atas kertas

6.      Hitung Rf yang teridentifikasi untuk masing-masing spot

Percobaan 2. Kromatografi Lapis Tipis

Kosentrasi standar fosfolipid (PC, PE dan PI) 1 mg/ml dilarutkan dalam larutan kloroform:metanol (95:5 v/v). Plat silika dikembangkan dengan larutan kloroform:metanol:air (110:25:3 v/v). Plat dikeringanginkan selama 10 menit dan diaktifkan selama 20 menit dalam oven suhu 100^oC sebelum digunakan. Dalam volume yang sama (10µl) sampel ekstrak fosfolipid dan standar fosfolipid diteteskan (spotting) pada plat. Kertas saring ditempatkan dalam bejana pengembangan (developing chamber) dan ditambahkan larutan pengembang. Bejana dijenuhkan selama 10 menit sebelum proses kromatografi. Plat yang berisi spot ditempatkan dalam bejana pengembangan selama 40 menit dan dikeringanginkan 10 menit dan ditempatkan dalam oven 90^oC selama 10 menit.

Deteksi fraksi-fraksi fosfolipid

            Deteksi destruktif (charring) terhadap fraksi fosfolipid yang terpisah dilakukan dengan dengan penyemprotan menggunakan larutan H₂SO₄ 50%. Fosfolipid terdeteksi dengan terbentuknya warna keabu-abuan setelah penyemprotan dengan larutan H₂SO₄ 50% dan pemanasan plat pada suhu 80⁰C selama 10 menit. Deteksi non destruktif dilakukan menggunakan lampu ultraviolet.

Kuantifikasi fraksi-fraksi fosfolipid

Jenis-jenis  fosfolipid diukur konsentrasinya dengan peralatan densitometer menghasilkan kurva dengan luas area tertentu.