BAB III. KARBOHIDRAT

Tujuan pecobaan

Setelah mempelajari teori dan melaksanakan prkatek, mahasiswa diharapkan dapat memahami cara menganalisis kadar karohidrat bahan hasil pertanian dan pangan.

Dasar percobaan

Karbohidrat terdapat dalam jaringan tanaman dan binatang, sedangkan yang terdapat dalam mikroorganisme bentuk dan levelnya sedikit berbeda. Karbohidrat yang terdapat dalam jaringan binatang umumnya berupa glukosa dan glikogen yang merupakan bentuk karbohidrat yang tersimpan, sedangkan yang terdapat dalam susu mempunyai bentuk khusus yaitu gula laktosa yng tergolong dalam disakarida. Pada jaringan tanaman, karbohidrat tersebar luas dari bentuk monosakrida, disakarida dan poli sakarida. Polisakarida struktural dalam jaringan tanaman berbentuk sellulosa. Gum merupakan kelompok polisakarida yang terdapat dalam jaringan tanaman, seaweed dan mikroorganisme. Sifat-sifat fisika dari gum ini dapat diterapkan secara luas pada berbagai macam pengolahan pangan. Karbohidrat terdapat dalam sejumlah produk olahan pangan.

Karbohidrat adalah polihidroksi keton atau polihidroksi aldehid dan meliputi kondesat polimer-polimer yang terbentuk. Nama karbohidrat dipergunakan pada senyawa-senyawa tersebut, mengingat rumus empiris yang berupa C_nH_2nO_n atau mendekati C_n(H₂O)_n yaitu karbon yang mengalami hidrasi. Namun demikian nama ini sebenarnya kurang tepat karena H₂O yang melekat pada gugus karbon bukanlah sebagai hidrat yang sebenarnya, misalnya tak dapat dipisahkan atau dikristalkan tersendiri yang terlepas dari gugusnya

Di alam, karbohidrat merupakan hasil sintesa CO₂ dan H₂O dengan pertolongan sinar matahari dan hijau daun (klorofil). Hasil sintesa ini kemudian mengalami polimerisasi menjadi bermolekul besar yang lain menjadi cadangan makanan pada tanaman. Organisme yang dapat mensintesa biomolekul untuk keperluan hidupnya dari bahan-bahan organik (misalnya CO₂ dan H₂O) disebut organisme autotroph. Sedangkan mikroorganisme pada umumnya, hewan dan manusia yang hanya dapat mempergunakan hasil sintesa organisme autotroph untuk keperluan hidup heterotroph. Karbohidrat merupakan sumber kalori atau makronutrient utama untuk organisme heteroroph. Sebagian lagi menjadi bahan utama sandang (kapas), industri (rami dan rosela) bahan bagunan (kayu, bambu). Disamping sebagai bahan sumber utama biokalori dalam bahan makanan misalnya gum (arabic, karaya, guar) sebagai bahan pengental, CMC sebagai bahan penstabil dan banyak lagi sebagai bahan pemanis (sukrosa, glukosa, fruktosa)

Secara alami ada tiga bentuk karbohidrat yang penting yaitu monosakarida, disakarida dan polisakarida. Polisakarida merupakan kelompok karbohidrat yang paling banyak terdapat di alam. Polisakarida merupakan senyawa makromolekul yang terbentuk dari banyak sekali satuan (unit) monosakarida. Jumlah polisakarida ini terdapat jauh lebih banyak dari oligosakarida  maupun monosakarida.

Sebagian dari polisakarida membentuk struktur tanaman yang tidak dapat larut misalnya selulosa dan hemiselullulosa. Sebagian lain membentuk senyawa cadangan pangan berbentuk pati dalam tanaman, glikogen pada sel-sel hewan. Karbohidrat cadangan pangan tersebut larut dalam air. Kelompok polisakarida lain berbentuk gum, pektin dan derivat-derivat lainnya.

Bentuk yang paling umum dari golongan oligosakarida adalah disakarida yang terdiri dari dua unit monosakarida yang terjadi dari proses kondensasi dari dua molekul monosakarida. Contoh yang paling umum dari disakarida ini adalah sukrosa atau sakarosa. Oligosakarida yangmengandung tiga, empat atau lebih unit monosakarida sangat jarang terdapat di alam. Bahan monosakarida yang terdapat dalam perdagangan umumnya dibuat melalui proses hidrolisa bahan polisakarida. Bahan monosakarida untuk makanan dan obat-obatan misalnya glukosa, fruktosa sering dibuat dar jagung, ketela dan sebagainya. Mono dan disakarida pada umumnya disebut gula-gula atau sugars.

Sifat-sifat karbohidrat

Mono dan disakarida memiliki rasa manis, oleh sebab itu golongan ini disebut gula. Glukosa (gula anggur) dan fruktosa (gula buah) adalah contoh monosakarida yang banyak dijumpai di alam. Sukrosa (gula tebu, gula bit) dan laktosa (gula susu) adalah kelompok disakarida yang juga manis. Rasa manis dari gula-gula ini disebabkan oleh gugus hidroksil-nya. Trihidroksida (gliserol) dan oligo-hidroksi lainnya juga berasa manis. Sedangkan polisakarida tidak terasa manis karena molekulnya sedemikian besarnya sehingga tidak dapat masuk ke dalam sel-sel kuncup rasa yang terdapat dipermukaan ujung lidah.

Semua jenis karbohidrat baik mon-, di-, maupun polisakarida akan berwarna merah bila larutannya dalam air dicampur dengan beberapa tetes larutan α-naphtol (dalam alkohol) dan kemudian dialirkan dalam asam sulfat pekat dengan hati-hati sehingga tidak tercampur. Warna merah akan tampak pada bidang batas antara campuran karbohidrat dengan α -naphtol dan asam sulfat pekat. Sifat ini dipakai sebagai dasar uji kuantitatif adanya karbohidrat dan dikenal sebagai uji Mulisch

Warna biru kehijauan akan timbul apabila larutan karbohidrat dicampur dengan asam sulfat dan anthrone. Warna ini timbul karena terbentuknya furfural dan hidroksi furfural sebagai senyawa derivat dari gula-gula

Bahan percobaan :

Biji-bijian, sayuran, buah-buahan dan umbi-umbian

Alat percobaan

Alat gelas, pipet ukur, spektofometer

Percobaan 1. Penentuan Gula total  dengan spektofometer metode Antrone

Prinsip : Karbohidrat  oleh asam sulfat dihidrolisis menjadi monosakarida. Monosakarida mengalami dehidrasi oleh asam sulfat menjadi HMF/furfural. HMF/furfural bereaksi dengan anthrone (9,10-dihidro-9-oxoanthrasene) membentuk warna spesifik biru kehijauan. Kelemahan: semua Karbohidrat (tidak hanya monoskarida) terdeteksi.  Komponen HMF/furfural dalam bahan dapat mengganggu analisis seperti pada madu

Prosedur : Tahap analisis pada sampel bermula dari Penghilangan komponen pengganggu. Gula diekstrak dengan alkohol dalam kondisi basa, kemudian dilakukan penjernihan dengan penghilangan kekeruhan yang dapat mengganggu peneraan dengan spektro, selanjutnya dilakukan kuantifikasi kadar gula

Pereaksi :

1. Pereaksi anthrone 0,1% dalam asam sulfat pekat (dibuat pada waktu akan digunakan)
2. Larutan glukosa standar 0,2 mg/ml. Larutan 200 mg glukosa dalam 100 ml aquades. Ambil 10 ml encerkan menjadi 100 ml (1 ml = 0,2 mg glukosa)

Cara Kerja :

A.   Pembuatan kurva Standar

1. pipet ke dalam tabung reaksi 0,0 (blanko), 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ;1 ml larutan glukosa standar tambahkan akuades sampai total volume masing-masing tabung 1 ml
2. tambahkan dengan cepat 5 ml pereaksi Anthrone ke dalam masing-masing tabung reaksi di lemari asam
3. tutup tabung reaksi dan campur merata menggunakan vorteks
4. tempatkan dalam water bath 100^oC selama 12 menit
5. dinginkan dengan cepat menggunakan air mengalir
6. pindahkan dalam kuvet dan baca absorbansinya pada 630 nm lalu dibuat hubungan antara absorban dan mg glukosa

B.   Penetapan Gula pada Sampel

Persiapan sampel untuk penetapan gula

1.      timbang sampel 20-30 g, tambahkan alkohol 80% dengan perbandigan 1 :1

2.      hancurkan bahan dengan waring blender sampai semua gula terekstrak

3.      saring sampel dengan menggunakan kapas. Sisa padatan pada kapas dicuci dengan alkohol 80% sampai seluruh gula terlarut.

4.      pH filtrat diukur, jika asam tambahkan CaCO₃ sampai cukup basa. Filtrat dipanaskan pada penangas air 100^oC selama 30 menit saring kembali dengan menggunakan kertas saring Whatman No 2

5.      Hilangkan alkohol dengan memanaskan filtrat pada penangas air yang suhunya dijaga ± 85 ^oC jika akan kering tambahkan air dengan volume tertentu dan kocok agar tercampur merata, tambahkan Pb Asetat jenuh jika perlu. Larutan siap digunakan.

6.      Masukkan 1 ml sampel (dari persiapan sampel) ke dalam tabung reaksi

7.      Selanjutnya lakukan tahap A2 sampai A6 (seperti pada pembuatan kurva standar)

8.      Tentukan konsentrasi gula total dalam sampel dengan menghubungkan dengan kurva standar

Percobaan 2. Penentuan Serat Kasar

Serat kasar adalah Kompoenen bahan pangan yang tidak tercerna yang dinyatakan sebagai komponen tidak larut asam/alkali encer. Residu hasil digesti diantaranya adalah  serat kasar yang terdiri dari lignin dan selulosa.

Prinsip : Komponen dalam sampel yang tidak larut dalam asam dan alkali encer dengan pemanasan dan pendingin balik dalam kondisi tertentu, dicuci dan dikeringkan kemudian ditimbang dan dinyatakan sebagai serat kasar dalam bahan sampel.

Cara Kerja :  

1.    Haluskan bahan sehingga dapat melalui ayakan diameter 1 mm dan campurlah baik-baik. Kalau bahan tak daat dihalsukan, hancurkan sebaik mungkin

2.    Timbang 2 g bahan kering pindahkan bahan ke dalam erlenmeyer 600 ml. Kalau ada tambahkan 0,5 g asbes yang telah dipijarkan dan 3 tetes zat anti buih (antifoaming agent)

3.    Tambahkan 200 ml larutan H₂SO₄ mendidih (1,25 H₂SO₄ pekat/100 ml = 0,255 N H₂SO₄) dan tutuplah dengan pendinginbalik, didihkan selama 30 menit dengan kadangkala digoyang-goyangkan.

4.    Saring suspensi melalui kertas saring dan residu yang tertinggal dalam erlenmeyer dicuci dengan aquades mendidih. Cucilah residu dalam keras saring sampai air cucian tidak bersifat asam lagi (diuji dengan kertas lakmus)

5.    Pindahkan secara kuantitatif residu dari kertas saring ke dalam erlenmeyer kembali dengan spatula, dan sisanya dicuci dengan larutan NaOH mendidih (1,25 g NaOH/100 ml = 0,313 N NaOH) sebanyak 200 ml sampai semua residu masuk ke dalam erlenmeyer. Didihkan dengan pendingin balik sambil kadangkala digoyang-goyang selama 30 menit

6.    Saringlah melalui kertas saring kering yang telah diketahui beratnya atau krus Gooch yang telah diijarkan dan telah diketahui beratnya, sambil dicuci dengan larutan K₂SO₄ 10%. Cuci lagi residu dengan aquades mendidih dan kemudian dengan lebih kurang alkohol 95%

7.    Keringkan kertas saring atau krus dengan isinya pada suhu 110^oC sampai berat konstan (1-2 jam), dinginkan dalam desikator dan timbang

8.    Berat residu = berat serat kasar

Percobaan 3. Penentuan Gula Reduksi dengan Luff Schrool

Prinsip : gula dalam sampel direaksikan dengan Luff Schrool berlebih, kelebihan Luff Schrool dititrasi dengan larutan baku Na-thiosulfat. Pada penentuan gula metode Luff Schrool, yang ditentukan bukan Cupro-oksida yang mengendap, tetapi dengan menentukan Cupri-oksida dalam larutan sebelum direaksikan dengan gula reduksi (titrasi blanko) dam sesudah direaksikan dengan gula reduksi (titrasi sampel). Penentuannya dengan titrasi menggunakan Na-thiosulfat. Selisih titrasi blanko dengan titrasi sampel ekuivalen dengan Cupro-oksida yang terbentuk dan juga ekuivalen dengan jumlah gula reduksi yang ada di dalam bahan. Reaksi yang terjadi selama penentuan karbohidrat cara ini, mula-mula Cupro-oksida yang ada dalam reagen akan membebaskan ion iod dari gara, K-iodida. Banyaknya Iod yang dibebaskan ekuivalen dengan titrasi menggunakan Na-thiosulfat. Untuk mengetahui bahwa titrasi sudah cukup maka digunakan indikator amilum. Bila larutan sudah berubah warna dari biru menjadi putih, berarti menandakan titik akhir titrasi.  

Cara kerja :

1.    Timbang bahan padat yang sudah dihaluskan atau bahan cair sebanyak 2,5 – 25 gram (tergantung bahan), dan pindahkan ke dalam labu takar 100 ml, tambahkan aquades 25 ml. Tabahkan bubur Al(OH)₃ atau larutan Pb-asetat. Penambahan larutan penjernih ini diberikan setetes demi setetes sampai penetesan reagensia tidak menimbulkan perubahan lagi. Kemudian tambahkan aquades sampai tanda dan disaring

2.    Filtrat ditampung dalam labu takar 200 ml, untuk menghilangkan kelebihan Pb ditambahkan Na₂CO₃ anhidrat atau K atau Na Oksalat anhidrat secukupnya, kemudian ditambah aquades sampai tanda, digojog dan disaring. Filtrat bebas Pb bila ditambah Na₂CO₃ anhidrat secukupnya, kemudian ditambah aquades sampai tanda, digojog dan disaring. Filtrat bebas Pb bila ditambah Na₂CO₃ anhidrat atau K atau Na-oksalat anhidrat atau Na-fosfat akan tetap jernih kemudian dtambah aquades hingga tanda

3.    Ambil 25 ml filtrat bebas Pb yang diperkirakan mengandung 15-60 mg gula redksi dan ditambahkan 25 ml larutan Luff Schrool dalam erlenmeyer

4.    Buat blanko yaitu 25 ml larutan Luff Schrool dengan 25 ml aquades

5.    Setelah ditambahkan beberapa butir batu didih, erlenmeyer dihubungkan dengan pendingin balik, kemudian didihkan. Diusahakan 2 menit sudah mendidih, pendidihan dipertahankan selama 10 menit.

6.    Larutan didinginkan dan kemudian ditambah 15 ml KI 20% dan dengan hati-hati ditambahkan 25 ml asam sulfat 26,5%

7.    Yodium yang dibebaskan dititrasi dengan Na-thiosulfat 0,1 N memakai indikator pati sebanyak 2-3 ml. Untuk memperjelas perubahan warna pada akhir titrasi maka sebaiknya pati diberikan pada saat titrasi hampir berakhir.

Perhitungan

Dengan mengetahui selisih antara titrasi blanko dan sample, maka kadar gula reduksi dalam bahan dapat dicari dengan menggunakan tabel.

Percobaan 4. Penentuan Gula Reduksi dengan Nelson-Somogyi

Prinsip : Gula memiliki kemampuan untuk mereduksi larutan alkali dari Cu, Ag dan Hg, namun yang paling sering digunakan adalah larutan alkali Cu. Gula pereduksi akan mereduksi ion Cupri (Cu2+) menjadi Cupro Oksida (Cu₂O). Ion Cupro ini kemudian dioksidasi oleh arsenomolibdat yang membuat larutan menjadi berwarna biru/hijau. Larutan kemudian diukur nilai absorbansi nya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540nm. Kepekatan warna sebanding dengan jumlah gula reduksi yang ada pada sampel.

Cara Kerja :

A.   Pembuatan Kurva Standar

1.    Buat larutan glukosa standar (10mg glukosa/100 mL)

2.    Dari larutan glukosa standar tersebut dilakukan 6 kali pengenceran sehingga diperoleh larutan glukosa dengan konsentrasi 2,4,6,8,10 mg/100 mL

3.    Siapkan 7 buah tabung reaksi bersih, masing-masing diisi dengan 1 mL larutan glukosa standar tersebut. 1 tabung diisi 1 mL akuades sebagai blanko

4.    Tambahkan ke dalam masing-masing tabung tersebut pereaksi nelson dan dipanaskan pada penangas air mendidih selama 20 menit

5.    Dinginkan pada air mengalir, sampai mencapai suhu 25⁰C

6.    Ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat, tabung digojog sampai semua endapan Cu2O larut kembali

7.    Tambahkan 7 mL akuades lalu diukur absorbansi nya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540nm

B.   Penentuan Gula reduksi Contoh

1.    Timbang sampel 20-30 g, tambahkan alkohol 80% dengan perbandigan 1 :1

      hancurkan bahan dengan waring blender sampai semua gula terekstrak

2.    Saring sampel dengan menggunakan kapas. Sisa padatan pada kapas dicuci dengan alkohol 80% sampai seluruh gula terlarut.

3.    pH filtrat diukur, jika asam tambahkan CaCO₃ sampai cukup basa. Filtrat dipanaskan pada penangas air 100^oC selama 30 menit saring kembali dengan menggunakan kertas saring Whatman No 2

4.    Hilangkan alkohol dengan memanaskan filtrat pada penangas air yang suhunya dijaga ± 85 ^oC jika akan kering tambahkan air dengan volume tertentu dan kocok agar tercampur merata, tambahkan Pb Asetat jenuh jika perlu. Larutan siap digunakan.

5.    Masukkan 1 ml sampel (dari persiapan sampel) ke dalam tabung reaksi

6. Selanjutnya lakukan tahap B4 sampai B7 (seperti pada pembuatan kurva standar)
7. Tentukan konsentrasi gula total dalam sampel dengan menghubungkan dengan kurva standar